Chỉnh sửa hệ gene bằng CRISPR-Cas

Một trong những mục tiêu lớn của công nghệ sinh học là chỉnh sửa hệ gene (genome editing) của các sinh vật, gồm cả con người, một cách chính xác, nhanh chóng, thuận tiện và ít tốn kém. Vài năm gần đây, một công nghệ mới tên là CRISPR-Cas xuất hiện, hứa hẹn sẽ biến việc chỉnh sửa hệ gene trở thành một kỹ thuật phổ biến như kỹ thuật chuyển gene thực vật ngày nay. Hãy cùng tìm hiểu xem kỹ thuật này là như thế nào nhé!

Một số thuật ngữ chính

CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeat, tạm dịch: cụm đoạn lặp xuôi ngược ngắn phân cách đều.

Cas: CRIPS-associated ([yếu tố] đi kèm với CRISPR)

ncRNA: non-conding RNA, là các RNA không mã hóa protein

CRISPR được tìm thấy ở hầu hết cổ khuẩn archaea (~90%) và ở nhiều vi khuẩn (~40%). Nó là trình tự lặp phổ biến nhất ở vi khuẩn, chiếm tới 40-70% lượng trình tự lặp ở một số loài.

Cấu trúc của CRISPR trong genome vi khuẩn

Nghiên cứu cho thấy tổ chức của CRISPR trong genome vi khuẩn rất đa dạng. Một locus (vị trí) CRISPR cấu thành từ các đoạn lặp (repeats) dài 21 đến 48 bp xen kẽ bởi các trình tự dài 26 đến 72 bp gọi là các đoạn đệm (spacers). Trong một locus thì kích thước của đoạn lặp và đoạn đệm rất ổn định. Mỗi locus CRISPR được đặc trưng bởi trình tự của đoạn lặp điển hình trong locus đó. Một locus CRISPR chỉ chứa các đoạn lặp và các đoạn đệm, không có khung đọc mở (open reading frame).

Hình 1. Một locus CRISPR

Thường thì trong một locus CRISPR, trình tự đoạn lặp rất bảo thủ. Hầu hết các đoạn lặp có tính palindromic một phần (nghĩa là một phần trình tự xuôi và ngược giống nhau), dẫn đến khả năng hình thành nên cấu trúc thứ cấp ổn định, bảo thủ cao.

CRISPR thường nằm trong nhiễm sắc thể, nhưng cũng có trường hợp nằm trong plasmid.

Phía thượng nguồn của một locus CRISPR là leader region (là trình tự đánh dấu sự bắt đầu của một CRISPR array; CRISPR array là trình tự bao gồm các đoạn đệm và lặp) dài từ 20 đến 534 bp. Locus CRISPR được phiên mã do một promoter nằm trong leader region. Ngoài ra, luôn tìm thấy vài gene đi kèm CRISPR (CRISPR-associated – Cas) ở vùng lân cận, tạo thành hệ thống CRISPR-Cas (bao gồm locus CRISPR và các gene Cas lân cận). Một hệ thống CRISPR-Cas thường gồm 4 đến 20 gene cas khác nhau. Các gene cas mã hóa một họ protein lớn và đa dạng có các domain điển hình của nuclease, helicase, polymerase và các protein gắn polynucleotide. Các gene cas này có thể nằm ở phía thượng nguồn hay hạ nguồn của vùng lặp/đệm.

Hình 2. Một locus CRISPR tổng quát. Các mũi tên trắng lớn biểu diễn các gene casphía thượng nguồn của locus CRISPR. L chỉ ra leader region, kèm với kích thước có thể của nó. Hình thoi đen (trình tự được bôi đen trong khung) là các trình tự lặp trong CRISPR1 của Streptococcus thermophilus strain DGCC7710. Các chữ nhật nhỏ tô màu (các trình tự tô màu trong khung) chỉ ra các trình tự khác nhau của đoạn đệm spacer có kích thước tương tự có trong một CRISPR.

Đặc điểm thường thấy
Các đoạn lặp (repeats) - Có từ 2 đến 375 đoạn lặp trong mỗi vùng (locus) - Trình tự đoạn lặp ít biến đổi - Đoạn lặp dài từ 21 đến 48 bp.	Các đoạn đệm (spacers) - Có từ 1 đến 374 đoạn đệm trong mỗi locus - Trình tự biến đổi - Đoạn đệm dài từ 26 đến 72 bp.

Có thể có nhiều locus CRISPR trong hệ gene của sinh vật prokaryote. Số lượng lớn nhất phát hiện được cho tới nay là 20 locus CRISPR trong hệ gene của Methanococcus jannaschii. Các đoạn lặp và đệm trong CRISPR có thể chiếm tới 1% tổng trình tự toàn hệ gene của vi khuẩn. Có nhiều suy đoán về vai trò của CRISPR như vai trò trong tái sắp xếp nhiễm sắc thể, điều hòa biểu hiện của các gene lân cận, sửa chữa DNA… Năm 2005, ba nghiên cứu độc lập cho thấy sự tương đồng giữa trình tự của các đoạn đệm (spacers) với các yếu tố ngoại nhiễm sắc thể như plasmid và virus. Điều này dẫn tới giả thuyết rằng CRISPR có thể đóng vai trò miễn dịch thích nghi (adaptive immunity) chống lại các yếu tố di truyền ngoại lai.

CRISPR, Cas và khả năng miễn dịch

Năm 2007, một nghiên cứu quan trọng trên vi khuẩn Streptococcus thermophilus (vi khuẩn sử dụng trong ngành công nghiệp sữa) được đăng tải. Việc sử dụng loài vi khuẩn này trong công nghiệp thường bị đe dọa bởi các thực khuẩn thể (phage – các virus tấn công vi khuẩn) nên các nhà nghiên cứu thường chọn lọc các chủng vi khuẩn kháng được thực khuẩn thể. Bài báo cho thấy rằng, trong quá trình tạo nên các chủng vi khuẩn mới kháng thực khuẩn thể, vi khuẩn thường thay đổi các CRISPR bằng cách tích hợp thêm các đoạn lặp-đệm mới vào một đầu của CRISPR. Các trình tự được tích hợp mới này giống hệt với trình tự có trong các thực khuẩn thể dùng trong nghiên cứu chọn lọc, gợi ý rằng các đoạn lặp-đệm mới đó có nguồn gốc từ nucleic acid của thực khuẩn thể. Để kiểm nghiệm điều này, trình tự của đoạn đệm được biến đổi, và quả thực là việc chèn thêm đoạn đệm có thể tạo ra tính kháng thực khuẩn thể, còn việc xóa đoạn đệm khiến vi khuẩn mất tính kháng. Phát hiện này được xác nhận trên Streptococcus mutans, trong đó các chủng kháng thực khuẩn thể có thêm các đoạn đệm mới trong CRISPR với trình tự giống hệt trình tự trong genome thực khuẩn thể. Không những có khả năng ngăn chặn được sự tấn công của virus, các CRISP còn có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các plasmid. Hơn nữa, các nghiên cứu về động học genome cho thấy rằng các locus CRISPR tiến hóa để đáp ứng với sự tấn công của virus.

Nghiên cứu sâu hơn cho thấy, các đoạn spacer có trình tự tương đồng với trình tự của virus hay plasmid ngoại lai đóng vai trò định hướng đối tượng, còn nhiệm vụ phá hủy, hay cắt, DNA của virus và plasmid ngoại lai đó là do các protein Cas đảm nhiệm. Như đã nói ở trên, một số gene cas mã hóa nên các nuclease, và khi được định hướng tới mục tiêu, các nuclease này sẽ cắt đứt đoạn DNA hoặc RNA mục tiêu ở một vị trí nhất định. Như vậy, trong hệ thống CRISPR-Cas thì CRISPR chứa trình tự mục tiêu giúp hệ thống nhận biết mục tiêu cần can thiệp, còn Cas phá hủy (cắt) mục tiêu.

Có rất nhiều gene cas khác nhau, và phân tích hệ gene của 200 vi khuẩn và cổ khuẩn cho thấy có thể có tới 45 họ gene cas.

Hệ thống phân loại hiện tại chia CRISPR-Cas vào hai lớp. Lớp 1 sử dụng nhiều protein Cas để phá hủy nucleic acid ngoại lai. Các hệ thống thuộc lớp 2 sử dụng một protein Cas duy nhất cho mục đích này. Lớp 1 được chia nhỏ thành các Kiểu I, III và IV. Lớp 2 được chia thành các Kiểu II và V.

Cơ chế miễn dịch tổng quát của hệ thống CRISPR-Cas

Tiếp nhận các đoạn đệm

Khi một vi khuẩn bị virus tấn công, bước đầu tiên của đáp ứng miễn dịch là bắt giữ DNA của virus và chèn một phần DNA này vào một locus CRISPR dưới dạng đoạn đệm (spacer). Cas1 và Cas2 được chứng minh là có liên quan tới quá trình này.

Các đoạn DNA của virus mà được vi khuẩn chọn để làm spacer được gọi là các protospacer (tiền spacer). Phân tích cho thấy vi khuẩn không chọn các đoạn này một cách ngẫu nhiên, mà các đoạn này thường nằm cạnh một đoạn DNA ngắn (3-5 bp) được gọi là các motif liền kề protospacer (protospacer adjacent motifs – PAM). Các đoạn PAM này là quan trọng với các hệ thống CRISPR-Cas kiểu I và II. Trong các hệ thống kiểu này, các protospacer bị cắt một đầu cạnh PAM, còn đầu kia dựa theo một kích thước nhất định (ví dụ, 20 bp kể từ đầu gần PAM), do đó duy trì một kích thước nhất định của các đoạn spacer trong hệ thống CRISPR-Cas. Các đoạn spacer mới thường được chèn về hướng trình tự leader (hình 1).

Hình 3. Lược đồ minh họa sự tiếp nhận đoạn đệm (spacer) mới từ DNA của thực khuẩn thể hoặc plasmid xâm nhập vào vi khuẩn. Các protein Cas1 và Cas2 cắt DNA ngoại lai thành các đoạn ngắn. Các đoạn spacer mới được tích hợp vào dãy (array) CRISPR phía gần với leader region.

Sinh tổng hợp và can thiệp

crRNA (CRISPR-RNA) là trình tự RNA sau này sẽ định hướng Cas nuclease tới mục tiêu trong quá trình can thiệp và được phiên mã từ trình tự CRISPR. Ban đầu, crRNA được phiên mã thành một sản phẩm phiên mã (transcript) dài duy nhất bao gồm hầu hết dãy trình tự lặp-đệm trong CRISPR. Sản phẩm phiên mã này sau đó được các protein Cas cắt nhỏ thành các crRNA riêng rẽ.

Các crRNA liên kết với các protein Cas để tạo thành phức hợp nhận biết và phá hủy các nucleic acid ngoại lai. crRNA không phân biệt giữa DNA mã hóa với không mã hóa.

Hình 4. (a) Ở giai đoạn can thiệp, các đoạn lặp và đệm trong dãy CRISPR được phiên mã thành một sản phẩm dài duy nhất, sợi này sau đó được xử lý bởi một phức hợp gọi là CRISPR-associated complex for antiviral defence (Cascade – phức hợp kháng virus đi kèm CRISPR) trong Escherichia coli hoặc bởi Cas6 trong Pyrococcus furiosus, tạo ra các CRISPR RNA (crRNA) nhỏ. crRNA có khả năng hình thành cấu trúc vòng (kẹp tóc) như trong hình. Sự phiên mã của CRISPR dường như là liên tục (constitutive) và leader region đóng vai trò như promotor. (b) crRNA đóng vai trò dẫn đường cho phức hợp tác động (effector complex) cấu thành nên từ các (hoặc chỉ một) protein Cas. Phức hợp này nhận biết DNA ngoại lai và cắt đứt đoạn DNA ở một vị trí thích hợp, do đó ngăn chặn được sự xâm nhập và ảnh hưởng của DNA ngoại lai này.

Các bước nêu trên là các bước cơ bản trong cơ chế miễn dịch nhờ CRISPR-Cas. Hệ thống này rất đa dạng (ví dụ, có tới 45 họ gene cas khác nhau) nên chi tiết sẽ khác nhau với từng hệ thống. Ví dụ, có hệ thống yêu cầu phải có trình tự PAM trong crRNA, trong khi các hệ thống khác thì không. Có hệ thống bao gồm nhiều protein Cas với các nhiệm vụ khác nhau (xử lý sản phẩm phiên mã crRNA, phá hủy DNA ngoại lai), có hệ thống sử dụng một protein Cas (ví dụ, Cas9) đa năng duy nhất.

Đặc điểm chủ chốt của hệ thống CRISPR-Cas là (1) tạo ra điểm đứt gãy sợi kép trên DNA và (2) điểm đứt gãy này được định vị một cách chính xác nhờ đoạn crRNA định hướng. crRNA được phiên mã từ DNA, mà DNA có thể dễ dàng được tổng hợp nên sử dụng hệ thống CRISPR-Cas có thể tạo ra điểm đứt gãy sợi kép ở bất kỳ vị trí mong muốn nào.

Đối với virus hoặc plasmid, các đứt gãy sợi kép trên DNA của chúng nghĩa là chúng bị phá hủy, không còn có thể hoạt động được nữa. Tuy nhiên, nếu các đứt gãy này xảy ra với DNA trong hệ gene của một tế bào chẳng hạn, thì ngay lập tức tế bào có cơ chế để sửa chữa DNA. Bước sửa chữa điểm đứt gãy này chính là thời điểm công nghệ chỉnh sửa gene vào cuộc.

CRISPR-Cas9 và ứng dụng trong chỉnh sửa hệ gene (genome editing)

Số lượng bài báo đề cập đến CRISPR đã tăng vọt từ mấy chục bài trong năm 2010 lên tới hơn 600 bài trong năm 2014. Biểu đồ sau thể hiện số lượng bài báo đề cập đến CRISPR qua các năm từ 2010 đến 2014, kèm theo dự báo cho năm 2015.

Hình 5. Tốc độ tăng trưởng theo cấp số mũ của số lượng các bài báo về CRISPR.

Sở dĩ CRISPR được quan tâm nghiên cứu vì khả năng ứng dụng mạnh mẽ và dễ dàng trong việc tinh chỉnh gene, dễ dàng hơn nhiều so với các công nghệ tinh chỉnh gene khác. Phần sau đây sẽ tập trung mô tả hệ thống CRISPR-Cas9, là hệ thống được nghiên cứu và khai thác rộng rãi nhất hiện nay.

CRISPR-Cas9 và cơ chế hoạt động

Hình 6. minh họa cơ chế hoạt động của CRISPR-Cas9, là hệ thống thuộc kiểu II-A, trong Streptococcus SF370. (a) Tổ chức của hệ thống CRISPR-Cas9 trong Streptococcus pyogenes SF370. Có 4 gene cas trong hệ thống là cas9, cas1, cas2 và csn2; 3 genes sau được cho là liên quan tới sự tích hợp các trình tự spacer mới vào CRISPR array. Sau các gene cas là một CRISPR array chứa bảy đoạn lặp (màu trắng, dài 36 nt) và sáu đoạn đệm (tô màu, dài 30 nt) có trình tự tương ứng với trình tự của các thực khuẩn thể của loài S. pyogenes. Phía trước các gene cas là gene mã hóa cho một đoạn RNA nhỏ gọi là trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) có trình tự tương đồng với trình tự của các đoạn lặp. (b). Quá trình xử lý crRNA. Locus CRISPR được phiên mã thành một đoạn dài duy nhất (gọi là tiền crRNA) chứa các đoạn lặp (màu xám) và đoạn đệm (các màu khác nhau). Được Cas9 hỗ trợ, tracrRNA tương tác với mỗi trình tự lặp để tạo nên các RNA sợi kép (double-stranded RNA – dsRNA) mà sẽ bị RNA III cắt, tạo ra các crRNA ngắn từ đoạn tiền crRNA dài. Các đoạn crRNA này được xử lý thêm ở đầu 5’, khiến cho trình tự định hướng chỉ còn dài khoảng 20 nt. Mũi tên đen chỉ ra vị trí xảy ra sự xử lý RNA. (c) Can thiệp đối tượng. Cas9 quét toàn bộ DNA sợi kép của đối tượng xâm nhập để tìm vùng bắt cặp bổ sung với crRNA và tạo ra đoạn cắt trên DNA sợi kép đó bằng cách sử dụng hai domain nuclease riêng rẽ là RuvC-like nuclease ở đầu N (cắt sợi DNA bổ sung), và HNH-like nuclease ở giữa protein (cắt sợi DNA không bổ sung). Yêu cầu phải có một trình tự NGG (gọi là trình tự PAM) ngay phía sau trình tự mục tiêu thì sự cắt mới xảy ra.

Nguồn: (Bikard and Marraffini, 2013)

Các hệ thống khác cần các protein Cas khác nhau cho bước xử lý crRNA và bước cắt DNA. CRISPR-Cas9 khác biệt ở chỗ nó chỉ cần một protein Cas duy nhất là Cas9.

Dựa trên cấu trúc tự nhiên của CRISPR-Cas9, các nhà nghiên cứu đã đơn giản hóa hệ thống này bằng cách kết hợp tracrRNA và crRNA thành một RNA định hướng duy nhất (single guide RNA – sgRNA). Cas9 định hướng bởi sgRNA được chứng minh là hiệu quả tương đương với Cas9 định hướng bởi tracrRNA và crRNA riêng rẽ. Để phục vụ cho mục đích chỉnh sửa gene, các thành phần không liên quan như leader region, các gene cas có vai trò khác, và các đoạn lặp bị loại bỏ. Gene mã hóa cho Cas9, RNA định hướng (sgRNA) chứa trình tự mục tiêu được kết hợp vào một plasmid biểu hiện nhỏ. Khi chuyển các plasmid này vào tế bào mục tiêu, Cas9 cùng sgRNA được biểu hiện đồng thời. Chúng kết hợp với nhau tạo thành một hệ thống CRISPR-Cas9 đơn giản mà hiệu quả, có thể tạo ra điểm đứt gãy trên DNA tế bào chủ tại vị trí mong muốn.

Hình 7: Các hệ thống CRISPR tự nhiên và nhân tạo. Các bước xảy ra với hệ thống CRISPR tự nhiên: 1. Phiên mã tạo ra tiền crRNA và tracrRNA 2. tracrRNA liên kết với crRNA 3. Tạo ra các RNA định hướng từ tiền crRNA 4. nuclease Cas9 đang ở trạng thái bất hoạt gắn kết với RNA định hướng để trở thành Cas9 hoạt hóa. CRISPR nhân tạo: 1. Phiên mã nên RNA định hướng thành một sợi duy nhất 2. Phiên mã và dịch mã tạo nên nuclease Cas9 3. RNA định hướng gắn với Cas9 và hoạt hóa Cas9. Nguồn: https://sites.tufts.edu/crispr/genome-editing/

Điểm đứt gãy sợi kép trên DNA có thể được sửa chữa theo hai hướng: non-homologous end-joining (NHEJ – nối đầu cuối không tương đồng) hoặc homology-directed repair (HDR – sửa chữa dựa theo sự tương đồng).

NHEJ thường dẫn tới các đột biến chèn hoặc xóa đoạn nhỏ, khiến cho gene mục tiêu bị bất hoạt. Có thể xóa một đoạn gene tương đối lớn nếu dùng hai crRNA, và có thể tạo ra sự chuyển vị hoặc đảo ngược nhiễm sắc thể nếu dùng crRNA định hướng tới hai nhiễm sắc thể khác nhau.

Nếu có một đoạn DNA mẫu (template DNA, hay donor DNA) tương đồng với vị trí mục tiêu thì DSB này có thể được sửa chữa bằng cơ chế HDR. Phần DNA ở quanh vị trí đứt gãy sẽ được thay thế bằng phần DNA tương ứng ở DNA mẫu. Nếu một đột biến được chủ ý đưa vào DNA mẫu thì đoạn DNA sau khi sửa chữa sẽ mang đột biến đó (Hình 8.A).

Nhưng ngay cả khi có DNA mẫu thì nhiều khả năng là không chỉ cơ chế HDR, mà cả NHEJ, cùng xảy ra, dẫn tới hiện tượng chèn/xóa đoạn không mong muốn. Một biến thể của Cas9 là Cas9D10A giúp hạn chế điều này. Cas9D10A chỉ có khả năng cắt DNA ở một sợi (chứ không phải ở cả hai sợi như Cas9 thông thường), do đó không kích hoạt cơ chế NHEJ. Khi có mặt DNA mẫu thì việc sửa chữa DNA chỉ được tiến hành theo cơ chế HDR mà thôi. Việc sử dụng nhiều hơn một phức hợp Cas9D10A để tạo nên các vị trí đứt gãy sợi đơn (nick) cạnh nhau giúp tăng đáng kể sự đặc hiệu mục tiêu (Hình 8.B).

Một biến thể khác nữa của Cas9 là nuclease-deficient Cas9 (dCas9, không có khả năng cắt DNA). Các đột biến xảy ra với HNH và RuvC domain bất hoạt khả năng cắt DNA, nhưng vẫn giữ lại khả năng liên kết với DNA. Một ứng dụng của biến thể này là biến dCas9 thành công cụ hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã khi dung hợp dCas9 với các domain tác động (hoạt hóa hoặc ức chế). Ngoài ra, có thể lợi dụng khả năng bắt cặp đặc hiệu trình tự của dCas9 với DNA để hiển thị trình tự DNA mong muốn trên genome bằng cách dung hợp dCas9 với protein huỳnh quang (Hình 8.C).