Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)

Sự phục hồi huỳnh quang sau khi tẩy màu bằng ánh sáng

Tất cả chất phát huỳnh quang phát xạ ra ánh sáng ở một bước sóng nhất định (ví dụ, xanh lá cây) sau khi chúng hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng khác (ví dụ, xanh dương). Tuy nhiên, nếu một nguồn sáng xanh dương cường độ rất cao chiếu vào chất phát huỳnh quang thì chất này sẽ bị “tẩy màu bằng ánh sáng – photobleaching”, nghĩa là nguồn sáng cường độ cao đã làm cho chất đó mất khả năng phát huỳnh quang.

Hiện tượng này dẫn đến một phương pháp rất hay gọi là FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Phục hồi phát quang sau khi bị tẩy màu bằng ánh sáng). Ý tưởng là sử dụng FRAP để xác định khả năng di chuyển của một phân tử qua thời gian. Để làm điều này, một chất phát huỳnh quang phải được gắn đồng hóa trị với phân tử quan tâm (ví dụ, protein, lipid, carbonhydrate). Sau đó quan sát phân tử quan tâm bằng kính hiển vi huỳnh quang dưới cường độ ánh sáng yếu (Hình 1).

Hình 1. Quan sát sự phát huỳnh quang trước khi tẩy màu.

Sử dụng kính hiển vi cho phép các nhà nghiên cứu tập trung ánh sáng vào một nhóm nhỏ các phân tử phát huỳnh quang. Một khi đã xác định được cường độ phát quang ban đầu của nhóm nhỏ phân tử này, chúng sẽ được chiếu bằng một nguồn ánh sáng cường độ rất mạnh. Về lý thuyết thì có thể gần 100% số phân tử phát huỳnh quang sẽ bị “tẩy màu” và khu vực chứa các phân tử này sẽ có màu đen hoàn toàn do mất khả năng phát quang.

Hình 2. Quan sát sự phát huỳnh quang sau khi tẩy màu. Khu vực bị tẩy màu bằng nguồn sáng công suất mạnh trở nên đen hoàn toàn.

Bây giờ sẽ có một khu vực đen do các phân tử bị tẩy màu, bao quanh bởi các phân tử gắn chất phát huỳnh quang khác không bị tẩy màu. Nếu những phân tử này có khả năng khuếch tán sang khu vực lân cận, ta có thể quan sát được. Khi chúng khuếch tán, các phân tử đã tẩy màu và các phân tử vẫn phát huỳnh quang sẽ trộn lẫn với nhau. Điều này sẽ làm cho khu vực phát quang trở nên kém sáng hơn, nhưng điều này khó mà đo lường được. Thay vào đó, khu vực bị đen sẽ dần trở nên sáng hơn khi các phân tử phát huỳnh quang di chuyển vào (Hình 3).

Hình 3. Quan sát sự phục hồi của ánh sáng huỳnh quang sau khi tẩy màu.

Có hai thông số có thể xác định được khi các phân tử phát huỳnh quang di chuyển vào khu vực bị tẩy màu:

1.            Sau khi sự khuếch tán đã ổn định thì cường độ phát quang của khu vực bị tẩy màu là bao nhiêu so với cường độ phát quang ban đầu đã xác định được? Đây gọi là phần trăm phục hồi.

2.            Tốc độ khuếch tán của các phân tử phát huỳnh quang trở lại vùng bị tẩy màu như thế nào? Tốc độ này giúp xác định “tính linh động khuếch tán” vốn thường được gọi là “tính linh động bên - lateral mobility” vì thí nghiệm chủ yếu được thực hiện với màng sinh học phẳng.

Dữ liệu thô được thu nhận bởi một cảm biến sáng đo ánh sáng đi quang kính hiển vi. Những dữ liệu này hiển thị trên màn hình máy tính và vào cuối thí nghiệm, máy tính sẽ cho ra đồ thị tương tự như hình 4.

Hình 4. Đồ thị biểu diễn dữ liệu thu được từ thí nghiệm FRAP. Đường cơ sở của cường độ phát huỳnh quang ban đầu (1) được thu thập trước khi tẩy màu (mũi tên xanh), sau đó cường độ phát huỳnh quang giảm đáng kể (2). Theo thời gian, cường độ huỳnh quang ở khu vực bị tẩy màu dần tăng lên khi các phân tử không bị tẩy màu khuếch tán trở lại khu vực đó (3). Sau đó sự phục hồi của cường độ huỳnh quang trở nên ổn định (4). Phần trăm phục hồi được tính toán: (Y/X)x100%. Tính linh động bên được xác định bằng hệ số góc (độ dốc) của đường cong (3). Đường cong càng dốc thì khả năng phục hồi càng cao, tương ứng với tính linh động cao của phân tử.

FRAP đã giúp xác định được mô hình khảm lỏng (fluid mosaic model) của màng tế bào. Nó cũng được dùng để xác định xem liệu một protein có khả năng di chuyển trong màng (phần trăm phục hồi cao tương ứng với tính linh động cao), hay là tính linh động của nó bị cản trở bởi các thành phần tế bào khác (phần trăm phục hồi thấp).

Video thực tế của FRAP:

10:28 AM