Single Molecule Real Time (SMRT) DNA sequencing technology – Pacific Biosciences

Công nghệ giải trình tự DNA đơn phân tử theo thời gian thực

Là công nghệ giải trình tự tiên tiến nhất hiện nay, đáng để bỏ công tìm hiểu xem nó hoạt động dựa trên công nghệ nào.

Trước hết cần phải nói là tất cả các công nghệ giải trình tự hiện nay (như  454 pyrosequencing hay Illumina (Solexa) sequencing) đều dựa trên phương pháp cơ bản do Frederick Sanger phát minh ra năm 1977, gọi là “phương pháp gián đoạn chuỗi” (chain-termination method). Trong phương pháp này, đoạn DNA cần giải trình tự được nhân lên in vitro bằng phản ứng PCR. Như vậy là trong môi trường phản ứng sẽ có đoạn DNA mẫu, primer, Polymerase II và 4 loại deoxynucleotide thông thường (dA, dT, dG, dC). Điểm mấu chốt của phương pháp Sanger là bên cạnh các nucleotide thông thường, người ta còn bổ sung thêm 4 loại dideoxynucleotides (ddA, ddT, ddG, ddC – không có nhóm 3’-OH tự do) theo một tỷ lệ nhất định (khoảng 1%). Các ddnucleotides (viết gọn là ddN) này có thể là phát phóng xạ hoặc gắn chất phát huỳnh quang.

Khi phản ứng khuếch đại diễn ra, Polymerase II sẽ đọc đoạn DNA mẫu và gắn các nucleotide vào theo nguyên tắc bổ sung để tạo ra một chuỗi DNA mới. Một cách ngẫu nhiên, nó có thể gắn 1 ddN vào chuỗi mới, và ngay sau đó quá trình kéo dài chuỗi bị gián đoạn do ddN này không có nhóm 3’-OH tự do để liên kết với một nuleotide khác nữa. Do tỷ lệ phù hợp của ddN trên dN mà phản ứng khuếch đại có thể tạo ra các đoạn full-length DNA, cũng như các đoạn khác có kích thước khác nhau bởi chỉ 1 nucleotide, tùy theo vị trí gắn của ddN. Sản phẩm sau PCR được chạy điện di để xác định kích thước.

Hình 1.

Hình 2.

Trong trường hợp ddN gắn nguyên tử phóng xạ thì phải tiến thành 4 phản ứng khuếch đại riêng biệt, trong mỗi phản ứng bổ sung một loại ddN khác nhau. Sản phẩm sau đó được chạy điện di trên 4 giếng khác nhau và kết quả điện di được đọc ngược từ cuối lên để xác định trình tự DNA (Hình 1.b và 2).

Trong trường hợp ddN được gắn với chất phát huỳnh quang thì có thể áp dụng một phản ứng khuếch đại cho cả 4 ddN. Sản phẩm sau khi điện di được chiếu các bước sóng thích hợp để kích thích các chất phát huỳnh quang phát ra ánh sáng ở các bước sóng đặc trưng (các màu đặc trưng). Bộ phận cảm biến ánh sáng của máy đọc trình tự (sequencing machine) sẽ đọc bản điện di và ghi nhận màu đặc trưng ứng với từng vị trí của vạch DNA, sau đó chuyển tín hiệu màu sắc thành ký tự A, T, G, C tương ứng (Hình 3).

Hình 3.

Phương pháp SMRT xác định trình tự DNA theo một cách hơi khác: nó “quan sát” quá trình tổng hợp một chuỗi DNA mới của DNA polymerase, xác định chính xác nucleotide nào trong 4 loại nu đang được gắn vào mạch, và như thế khi đoạn DNA được sao chép xong thì máy cũng xác định xong trình tự đoạn DNA đó. Đó là lý do tại sao nó có tên gọi Công nghệ giải trình tự DNA đơn phân tử theo thời gian thực.

Nguyên lý cơ bản là như sau: phản ứng tổng hợp DNA xảy ra trong một thể tích rất nhỏ. Thành phần phản ứng gồm: 1 phân tử DNA polymerase, 1 phân tử DNA mẫu, 4 loại nucleotide gắn gốc phát huỳnh quang phát ra các màu sắc khác nhau khi bị kích thích bằng tia laser. 4 loại nucleotide này có khả năng thực hiện phản ứng tổng hợp DNA như bình thường, tức là nó không làm ngừng quá trình phản ứng như ddn nói ở trên. Khi phản ứng tổng hợp DNA xảy ra, máy giải trình tự chiếu tia laser vào vùng phản ứng, tia laser sẽ kích thích nucleotide tương ứng đang được gắn vào mạch phát ra ánh sáng với màu đặc trưng. Màu này được ghi lại và chuyển thành ký hiệu A, T, G hay C. Khi phản ứng DNA hoàn thành thì việc giải trình tự cũng xong.

Để làm được điều này, nó phải giải quyết được 2 vấn đề sau:

-          các nucleotide phải được đánh dấu sao cho (1) khi một nucleotide được DNA polymerase gắn vào mạch mới theo nguyên tắc bổ sung, thiết bị giải trình tự xác định được nu đó là A, T, C hay G, và (2) việc đánh dấu này không làm gián đoạn việc tổng hợp mạch mới. Đây là điểm khác biệt quan trọng so với phương pháp Sanger.

-          phải đảm bảo rằng tại một thời điểm, ở một vị trí xác định chỉ có duy nhất một phân tử DNA được sao chép.

Để giải quyết vấn đề 1, mỗi nucletide được gắn với một gốc phát huỳnh quang riêng rẽ có khả năng phát ra ánh sáng ở các bước sóng khác nhau (màu sắc khác nhau) khi được kích thích bằng tia laser. Các gốc phát huỳnh quang (flurophore) này được gắn với phần đuôi triphotphat của nucleotide (Hình 4). Khi phản ứng sao chép DNA xảy ra, DNA polymerase sẽ cắt gốc phát huỳnh quang ở nhóm –NH để nối nucleotide này với nhóm –OH của nucleotide tiếp theo. Phần gốc phát huỳnh quang bị cắt ra này sẽ nhanh chóng bị khuếch tán ra ngoài khu vực hoạt động của DNA polymerase. Như vậy thì sau khi gắn xong 1 nucleotide mới, chuỗi DNA mới tạo thành sẽ là chuỗi bình thường, ko phát huỳnh quang, và sẵn sàng cho phản ứng gắn tiếp theo.

Hình 4. Cấu trúc phân tử của Cytosine. Gốc phát huỳnh quang fluorophore gắn vào phía đuôi triphotphat, ko phải là vùng base.

Để giải quyết vấn đề 2, Pacific Biosciences đã phát minh ra SMRT chip, là một bản cứng có chứa hàng ngàn khoang hình trụ nhỏ gọi là ZMW (zeromode waveguides).  Mỗi ZMW có đường kính khoảng 70nm và sâu khoảng 100nm. Mỗi ZMW này trở thành nơi xảy ra phản ứng tổng hợp DNA. Bản chip được đỡ bằng vật liệu trong suốt để máy giải trình tự có thể “quan sát” quá trình phản ứng (Hình 5).

Trong mỗi ZMW, 1 phân tử DNA polymerase duy nhất được gắn vào đáy (Hình 6). Kích thước siêu nhỏ của ZMW và phân tử DNA polymerase duy nhất trong mỗi ZMW đảm bảo rằng chỉ có một phân tử DNA duy nhất được sao chép khi tiến hành phản ứng.

Hình 5. Một ZMW

Hình 6. Một ZMW với 1 phân tử DNA polymerase được cố định ở đáy

Đây là giải pháp cực kỳ khéo léo của Pacific Biosciences khi nó vừa đảm bảo sự duy nhất của phản ứng sao chép DNA vừa tạo ra được một vùng quan sát phản ứng nhỏ xung quanh phân tử DNA polymerase. Theo lý thuyết thì trong khoang ZMW này sẽ có rất nhiều nucleotide tự do chuyển động ngẫu nhiên, và khi khoang được chiếu tia laser, tất cả các nucleotide này sẽ đồng loạt phát sáng và việc phát hiện nucleotide này đang được gắn vào chuỗi sẽ trở thành không thể. Tuy nhiên, đường kính siêu nhỏ của khoang MZW nhỏ hơn bước sóng của tia laser nên nó ngăn ngừa tia laser đi sâu vào trong khoang. Tia laser bị chặn lại ngay ở phần miệng khoang, và bước sóng tắt dần của nó đi sâu vào trong khoang thêm được khoảng 20-30nm nữa với cường độ giảm dần (là phần có màu từ đỏ thẫm đến vàng đến xanh nhạt) (Hình 7). Khu vực đó có thể tích rất nhỏ chỉ khoảng 20 zeptoliters (10-21 liters) (gọi là “thể tích phát hiện”), và chỉ có nucleotide nào nằm trong phạm vi đó mới bị kích thích. Với thiết kế này, ánh sáng huỳnh quang gây nhiễu tạo ra bởi các nucleotide tự do được giữ ở mức rất thấp.

Hình 7. Ánh sáng kích thích chỉ có tác động trong thể tích rất nhỏ (vùng từ đỏ đến vàng đến xanh nhạt)

Hình 8. Phản ứng gắn kết nucleotide vào mạch phát xạ ánh sáng có màu sắc tương ứng với mỗi nucleotide.

Như có thể thấy trên hình, mặc dù trong khoang phản ứng ZMW có nhiều phân tử nucleotide tự do nhưng chỉ có nucleotide nào nằm trong vùng “thể tích phát hiện” (màu cam) mới có thể được kích thích để phát sáng. Do thiết kế của khoang nên vùng “thể tích phát hiện” cũng là nơi cố định và là vùng hoạt động của DNA polymerase. Điều này đảm bảo rằng chỉ có nucleotide được DNA polymerase “bắt” lấy và gắn vào mạch mới phát sáng (Hình 8).

Quá trình sao chép DNA và giải trình tự xảy ra song song

Hình 9. Minh họa quá trình giải trình tự trong một ZMW

4 loại nucleotide gắn gốc phát huỳnh quang ở cuối đuôi triphotphat cho phép phản ứng sao chép DNA xảy ra liên tục với tốc độ cao. Khi DNA polymerase nhận biết loại nucleotide cần gắn vào, nó sẽ giữ nucleotide đó trên mạch khoảng  10 mili giây trong “thể tích phản ứng”. Khoảng thời gian này lâu hơn nhiều so với sự chuyển động khuếch tán ngẫu nhiên của các nucleotide tự do khác vào trong khu vực này. Tia laser được chiếu liên tục vào ZMW sẽ kích thích nucleotide này phát ánh sáng huỳnh quang tương ứng, ngay lập tức bộ phận cảm biến của máy ghi nhận tín hiệu màu và chuyển nó thành ký tự A, T, G hay C tương ứng (step 2). Sau khoảng 10 mili giây bị giữ lại trên mạch, DNA polymerase cắt đứt gốc phát huỳnh quang, gốc này bị khuếch tán ra khỏi vùng phản ứng, tín hiệu ánh sáng ghi nhận được trở lại mức nhiễu cơ bản gây ra bởi các nucleotide tự do đi vào vùng kích thích (step 3). Quá trình lặp lại ghi DNA polymerase kéo dài chuỗi.

Với công nghệ mới này, DNA được giải trình tự rất nhanh và hiệu quả, nó có thể xử lý những mạch dài hàng chục ngàn nucleotide. Công nghệ này có nhiều ưu điểm vượt trội so với các công nghệ giải trình tự hiện đang được sử dụng khác như tiết kiệm thời gian, sử dụng ít hóa chất, kích thước đoạn DNA có thể giải trình tự lớn, etc.

9:02 AM